Preanalytical conditions can interfere with M. tuberculosis detection by PCR in respiratory samples

OBJECTIVES: Tuberculosis is one of the most prevalent infections in humans. Although culture is the reference for diagnosis, its sensitivity is compromised, especially in paucibacillary samples. Because polymerase chain reaction (PCR) amplifies mycobacterial DNA, it is more sensitive than culture for the diagnosis of Mycobacterium tuberculosis (Mtb). However, its performance can be affected by intrinsic sample inhibitors and by the extraction/detection techniques used. METHODS: We evaluated the influence of preanalytical conditions on Mtb detection in samples of sputum (SPU), bronchoalveolar lavage (BAL), and pleural fluid (PF) using combinations of extraction/detection methods. Respiratory samples were prepared to contain different concentrations of red blood cells and nucleated cells to which increasing amounts of Mtb colonies were inoculated and submitted to PCR. RESULTS: Up to 102 CFU/ml of Mtb were detected in the SPU in all methods, except for the Roche extraction/detection method, regardless of the preanalytical sample condition. In BAL samples, medium and high concentrations of cells and high concentrations of red blood cells contributed to a lower Mtb detection, regardless of the extraction method used. In PF, red blood cells were the variable that most interfered with Mtb detection, with better recovery (102 CFU/ml) observed with the Qiagen/Nanogen combination. CONCLUSION: The choice of Mtb extraction and detection method is of fundamental importance for PCR analytical sensitivity, especially when paucibacillary samples and/or samples containing potential PCR inhibitors are analyzed.

Análise de interferentes na extração, amplificação e detecção de M. tuberculosis por reação de PCR em amostras de líquido pleural, escarro e lavado broncoalveolar / Analysis of interfering in the extraction, amplification and detection of M. tuberculosis by PCR reaction in pleural fluid, sputum and bronchoalveolar lavage samples

Introdução: A tuberculose (TB) é uma das infecções mais prevalentes na humanidade, sendo o comprometimento pulmonar a principal causa de morbimortalidade. A cultura é o padrão de referência para diagnóstico, porém apresenta baixa sensibilidade. Das formas extrapulmonares, a TB pleural é a mais comum e apresenta diagnóstico confirmatório difícil por ser paucibacilar e conter interferentes intrínsecos na amostra. A reação em cadeia da polimerase (PCR), por amplificar o DNA da micobactéria, apresenta-se como teste mais sensível que a cultura, sendo positivo em amostras que apresentam a partir de 102 UFC/mL (unidades formadoras de colônia por mL) de M. tuberculosis (MTB). Entretanto, quando utilizada em amostras de escarro, lavado broncoalveolar e/ou líquido pleural pode ter seu desempenho comprometido pela presença de inibidores intrínsecos da amostra (variáveis pré-analíticas) e pelas técnicas de amplificação e detecção (variáveis analíticas) utilizadas na reação. Objetivo: Avaliar a influência de variáveis pré-analíticas (concentração de células, hemácias e proteínas) na detecção do DNA do M. tuberculosis em amostras de escarro, lavado broncoalveolar (LBA) e líquido pleural (LP), utilizando combinações de métodos de extração/detecção. Métodos: Amostras de escarro, lavado broncoalveolar e líquido pleural de pacientes não infectados pelo M. tuberculosis foram obtidas através de indução à expectoração, broncoscopia respiratória e/ou toracocentese, respectivamente, em volumes suficientes para o estudo. Para testar o limiar de detecção do M. tuberculosis, as amostras foram preparadas "in vitro" de maneira a conter concentrações variadas dos interferentes pré-analíticos e de UFC/mL da micobactéria. Para a técnica de PCR, o DNA foi extraído pelo método de extração QIAamp® DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) e pelo AMPLICOR® Respiratory Specimen Preparation (Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ, USA) e amplificado...

Introdução: A tuberculose (TB) é uma das infecções mais prevalentes na humanidade, sendo o comprometimento pulmonar a principal causa de morbimortalidade. A cultura é o padrão de referência para diagnóstico, porém apresenta baixa sensibilidade. Das formas extrapulmonares, a TB pleural é a mais comum e apresenta diagnóstico confirmatório difícil por ser paucibacilar e conter interferentes intrínsecos na amostra. A reação em cadeia da polimerase (PCR), por amplificar o DNA da micobactéria, apresenta-se como teste mais sensível que a cultura, sendo positivo em amostras que apresentam a partir de 102 UFC/mL (unidades formadoras de colônia por mL) de M. tuberculosis (MTB). Entretanto, quando utilizada em amostras de escarro, lavado broncoalveolar e/ou líquido pleural pode ter seu desempenho comprometido pela presença de inibidores intrínsecos da amostra (variáveis pré-analíticas) e pelas técnicas de amplificação e detecção (variáveis analíticas) utilizadas na reação. Objetivo: Avaliar a influência de variáveis pré-analíticas (concentração de células, hemácias e proteínas) na detecção do DNA do M. tuberculosis em amostras de escarro, lavado broncoalveolar (LBA) e líquido pleural (LP), utilizando combinações de métodos de extração/detecção. Métodos: Amostras de escarro, lavado broncoalveolar e líquido pleural de pacientes não infectados pelo M. tuberculosis foram obtidas através de indução à expectoração, broncoscopia respiratória e/ou toracocentese, respectivamente, em volumes suficientes para o estudo. Para testar o limiar de detecção do M. tuberculosis, as amostras foram preparadas "in vitro" de maneira a conter concentrações variadas dos interferentes pré-analíticos e de UFC/mL da micobactéria. Para a técnica de PCR, o DNA foi extraído pelo método de extração QIAamp® DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) e pelo AMPLICOR® Respiratory Specimen...